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论文解读--异甘草甙通过招募巨噬细胞促进血管生成从而促进斑马鱼伤口愈合

出处:水生动物健康评估公众号 作者:小破同学 祥仔视觉祥仔视觉手机在线视频网 2020-04-06 21:38:00

甘草在南欧和亚洲部分地区广泛应用于治疗各种疾病。异甘草甙是甘草的水溶性异黄酮成分,据报道异甘草甙对斑马鱼胚胎受损的血管系统有额外的促血管生成作用,因此可能有治疗血管生成不足引起的病理疾病的潜力并推测异甘草甙可能具有促进皮肤伤口愈合的活性。今天给大家分享一篇文章——《Isoliquiritin promote angiogenesis by recruiting macrophages to improve the healing of zebrafish wounds》,以斑马鱼为创面愈合模型动物,探索并证实了异甘草甙在皮肤创面愈合中的药理活性,并通过转基因斑马鱼胚胎来阐明其潜在机制,引用信息如下:
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一、异甘草甙可以促进成年斑马鱼伤口愈合

为了确定伤口愈合率,将6个月大的野生型斑马鱼分为3组,每组10只。所有鱼麻醉后,在左侧肛门和背鳍间使用一次性无菌活检穿孔机打出一个直径2毫米的全层伤口。实验组分别使用100μg /毫升和200μg /毫升的异甘草甙溶液每天浸泡20分钟,处理7天。对照组使用0.1% DMSO处理。随后分别在1、3、5、7、10、12、15 dpw进行伤口检查。
结果发现所有组伤口在第三天达到最大创口面积后逐渐开始愈合(图1.B),且200μg/毫升的异甘草甙治疗组的伤口在第5/10/15天明显变小,愈合速度更快(图1.A)。
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图1. 斑马鱼伤口愈合分析

二、异甘草甙处理后斑马鱼创面愈合的组织学分析
选用创伤后第六天的斑马鱼进行创面愈合的组织学分析。H & E组织切片结果显示:异甘草甙处理后的斑马鱼创面完全充满了厚的上皮细胞层,真皮致密,而未处理的损伤组织伤口边缘只有一层薄的上皮细胞层(新上皮)。而且异甘草甙处理后的斑马鱼创面肉芽组织面积也明显小于对照组,说明肉芽组织迅速退化,加速了创面愈合的过程。此外,异甘草甙处理组的斑马鱼伤口肌肉组织更为致密,而对照组肌肉组织间隙较大,仍处于疏松分解状态。
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图2. H&E组织切片(含皮肤和肌肉)
 (A和C)对照组未处理,(B和D)为实验组:A、B: 200×;C和D: 400×。伤口面积用虚线标出。Ep:上皮细胞,gt:肉芽组织。小黑箭头:薄上皮,免疫细胞浸润;粗黑箭头:上皮层形成;黄色箭头:真皮层;红色箭头:真皮层分解的肌细胞;白色箭头:密集排列的肌肉细胞。

三、异甘草甙能够促进血管生成
为观察创面血管生成,受精后4天的斑马鱼(内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白EGFP)胚胎分为3组,每组35个。斑马鱼麻醉后用针刺入与泄殖腔相对的背体进行创面诱导。随后,胚胎立即转移到新鲜的胚胎水中恢复。2小时以后,将斑马鱼分别用100μg /毫升和200μg /毫升的异甘草甙溶液进浸泡,对照组用0.1% DMSO处理。实验结果发现与损伤2小时后的斑马鱼胚胎血管长度相比,异甘草甙处理组在24 小时以后血管新生长度明显长于对照组(图3.A)。定量分析24例hpw的虚线框内血管生成率(图3.B)。两组的血管生成率均显著高于对照组(P < 0.001),且呈浓度依赖性增高。这一结果表明异甘草甙可以促进创面愈合。
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图3. 异甘草甙能够促进血管生成

四、异甘草甙的促炎作用
为了阐明异甘草甙促进伤口血管生成与巨噬细胞之间的关系,使用了双转基因斑马鱼胚胎(内皮细胞-绿色荧光蛋白,巨噬细胞-红色荧光蛋白)进行实验。如图4所示,各组创面形成后,巨噬细胞均在一定时间内被招募到创面区域。对照组,巨噬细胞从2小时到24小时逐渐招募聚集(图4.A)。而异甘草甙处理组在每个时间点可以观察到有更多的巨噬细胞到达损伤部位。在6小时,两种浓度的异甘草甙处理组损伤部位的巨噬细胞都显著增加。
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图4. 异甘草甙能够促进血管生成

五、基因定量分析
在24小时,损伤组所有基因表达均高于非损伤组,尤其是sod1、tgf-β,tnf-α的表达,这可能表明斑马鱼胚胎往往有一个活跃的自愈能力。血管生成相关基因vegfa和 flk-1在200μg /毫升的异甘草甙溶液治疗组高表达,ang-2在两种异甘草甙处理组中的表达均呈剂量依赖性上调。炎症相关基因tgf-β, il-1β, tnf-α, mmp-9, mmp-13以及抗氧化基因sod1在200μg /毫升的异甘草甙溶液治疗组相对于创伤对照组高表达,除了mmp-9之外都呈计量依赖性。因此,推测异甘草甙可以通过上调血管生成相关基因和炎症基因加速炎症反应和血管生成,从而促进皮肤创面愈合。
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图5. 基因定分析

六、结论
综上所述,研究首次证明了异甘草甙可以促进斑马鱼皮肤伤口的愈合。其机制是促进炎症反应和促进血管生成。这一发现丰富了甘草的药用价值。异甘草甙可以作为一种潜在的伤口愈合药物。
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图6.甘草及异甘草甙
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