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环孢素A对斑点叉尾鮰疱疹病毒增殖的影响

出处:当代祥仔视觉 作者: 祥仔视觉祥仔视觉手机在线视频网 2017-01-14 19:10:00

斑点叉尾鮰(Ietalurus Punetaus)是从国外引进的一种重要的特种祥仔视觉祥仔视觉手机在线视频鱼类,深受消费者青睐。但随着祥仔视觉手机在线视频规模的不断扩大和集约化程度日益提高,祥仔视觉手机在线视频环境恶化,斑点叉尾鮰病害日趋严重,其中由斑点叉尾鮰疱疹病毒(channel catfish virus,CCV)引发的斑点叉尾鮰疱疹病毒病(channel catfish virus disease, CCVD)危害最大。CCVD的暴发造成鱼苗、鱼种的死亡率高达90%以上,且无有效的治疗方法,给斑点叉尾鮰的祥仔视觉手机在线视频生产造成了巨大的经济损失。大量研究表明,环孢素A(CsA)对多种病毒的增殖具有抑制作用,而关于CsA对CCV的作用尚未见报道。本研究通过体外实验研究CsA对CCV增殖的影响,以期为防治斑点叉尾鮰疱疹病毒病提供重要的实验依据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 细胞与培养

斑点叉尾鮰卵巢细胞系(channel catfish ovary cell,CCO)由华中农业大学祥仔视觉学院提供。CCO细胞用含10% FBS的DMEM培养基在280C含5% CO2的培养箱中培养。通常2~3d传代1次,将细胞用PBS洗1次,在每个T25培养瓶中加入1ml的胰酶消化1min左右,随后再将胰酶除去,最后再添加含有10% FBS的DMEM培养基15毫升,将细胞吹散,摇匀分到3个T25培养瓶中培养。

1.2 病毒与感染

CCV病毒由华中农业大学祥仔视觉学院提供。待CCO细胞生长状态良好时,以适当比例传代于大瓶中培养,24h内进行CCV的感染,首先吸去瓶中的细胞培养液,然后将细胞用无胎牛血清的DMEM细胞培养液清洗一遍,随后吸去没有用的废液,然后向细胞内加入稀释过107倍的CCV悬液0.5毫升,使液体覆盖细胞培养面,280C孵育1h,期间每隔20min轻摇晃一次使液体完全覆盖细胞培养面,之后吸弃CCV悬液,加入含5%胎牛血清的DMEM培养基,置于28℃培养、增殖,随后在显微镜下观察,当细胞完全病变后就放入-800C下保存。

1.3 抑制剂(CSA)的配制及其细胞毒性检测

将CSA粉末溶入DMSO中配制成不同的浓度分开装好后置于-200C冰箱中保存。在96孔板上接种CPB细胞,当细胞长到单层时,更换含有不同浓度CsA的培养液(0、2.5、5、10 、20、40μmol/L),在培养12h、24h、36h、48h和72h后用MTS法分别检测其细胞活性。

1.4  CSA对CCV病毒增殖的影响

在24孔细胞培养板上接种CCO,当细胞生长至55%左右融合时,就开始加入含不同浓度CSA培养基,同时设立DMSO为对照组,CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV,吸附完成后换入含不同浓度CsA的培养基,CCV感染后72h收取样品。用TCID50法检测病毒滴度。

1.5  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响

将CCO细胞接种于6孔细胞培养板中,等细胞长到50%~60%融合时,换入含有CsA的细胞培养液,同时设立DMSO为对照组。CsA作用12h后接种1 MOI 的CCV。另设一组接种无血清的DMEM培养基,作为正常细胞对照组。感染后12h、24h、36h和48h收取样品,加入TRizol试剂裂解,置于-80℃保存备用。

1.6 实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol试剂盒提取总RNA,按说明书进行。反转录使用PrimescriptR RT reagent Kit  With gDNA Eraser试剂盒,每个样品使用1μg总RNA进行反转录。使用SYBR染料法(Takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒)进行相对定量PCR,以斑点叉尾鮰的18s rRNA作为内参,用△△CT法计算,以全培养基组作为100%。使用ABI 7,500荧光定量PCR仪,反应条件为:首先95℃ 30s进行预变性;随后进行40个循环,反应为95℃ 5s,60℃ 34s。扩增反应完成后,进行溶解曲线分析,以确定引物的特异性。实验所用引物见表1。

表1   qRT-PCR引物
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2  结果与分析

2.1不同浓度CSA对CCO细胞毒性检测

从图1中可以看出,当CsA的浓度小于等于10μmol/L的时候,在各个时间点对CCO细胞的活力均无显著影响。因此,后续研究中使用CsA的最大浓度为10μmol/L。
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图1 MTS法检测CsA对CCO细胞的毒性

2.2  CSA对CCV病毒增殖的影响
从图2中可以看出,CsA浓度在0到10μmol/L之间,随着细胞中添加的CSA浓度的增加,细胞被病毒感染的感染率在不停降低,说明CsA对CCV的增殖起着抑制作用。
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图2 不同浓度CsA对CCV增殖的影响

2.3  CsA对CCV诱导的细胞因子表达的影响

CCV的感染会诱导宿主的先天性免疫反应,导致宿主的一些细胞因子的表达发生变化,为研究CsA 对CCV感染后的细胞因子表达的影响,于感染后的6h、12h、24h、36h、48h和72h分别收样,用qRT-PCR方法检测CPB细胞中细胞因子的变化。结果表明,CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达均有抑制作用(图3,图4)。
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图3 CsA对CCV感染后细胞中IL-8表达的影响
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图4  CsA对CCV感染后细胞中TNF-α表达的影响

3  讨论

环孢素A(CsA),是一种使用广泛、作用强效的免疫抑制剂,可以特异和可逆地作用于淋巴细胞,抑制淋巴细胞的激活和增殖,抑制某些细胞相关的炎症因子的产生和释放,从而起到抑制细胞免疫的作用。CsA是由11个氨基酸组成的多肽。CsA进入细胞后先与CypA形成复合物(CypA-CsA),再与钙调磷酸酶(calcineurin,CN)结合,抑制CN酶活性,从而使其底物—激活的T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NF-AT)不能去磷酸化,抑制了NF-AT从胞浆进入细胞核内形成转录复合体,进一步抑制IL-2、IL-4、γ-干扰素等细胞因子的转录。CsA通过在转录水平上通过阻断T细胞的活化,从而实现免疫抑制效果。

关于CsA对病毒增殖的抑制作用已有很多的研究报道。Kim等对猪流行性腹泻病毒(PEDV)研究发现,CsA能抑制PEDV诱导的细胞凋亡,进而抑制PEDV的增殖。CsA 对多种冠状病毒的增殖都有抑制作用。CsA通过调节干扰素途径的关键因子的表达,促进I型干扰素的先天性免疫功能,从而抑制轮状病毒的复制。在对甲型流感病毒和丙型肝炎病毒等研究中,也有类似的结果[10,11]。胡先勤等研究表明,CsA可以显著抑制鳜鱼虹彩病毒(ISKNV)的增殖。本文的研究结果表明,CsA也能显著抑制CCV的增殖,有关于其作用机理需要进行进一步研究。

病毒感染会诱导细胞产生炎症反应,本文研究结果表明,CsA对CCV感染后诱导的IL-8和TNF-α的表达有抑制作用。提示CsA对CCV感染诱导的细胞因子的表达具有调节作用,可能在相关信号通路中发挥重要作用,有关其具体机制需要进一步研究。

由于CsA对CCV的增殖具有显著的抑制作用,由此推测CsA及其衍生物将来可以作为防治CCV的候选药物。

(参考文献略)

【基金项目:武汉轻工大学大学生科研项目(xsky2016026);武汉轻工大学引进人才科研启动项目(2016RZ10)】

END



1、来源: 腾氏祥仔视觉商务网-当代祥仔视觉杂志社
2、作者: 武汉轻工大学 动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 周阳 胡先勤 周建军 彭银苏 王超 罗一帆 陈潜双
3、腾氏祥仔视觉商务网微信号:tsfish  

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发布人:webmaster
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